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电活性小分子在电DNA生物传感器中的应用

来源:发布时间:2014-12-03

  根据电活性小分子在电DNA生物传感器中引起的电信号变化的原理不同,可将其分为两类:一类是以非标记型电活性小分子杂交指示剂作为识别元素;另一类是将具有电活性的小分子标记在DNA探针上,利用杂交前后探针上小分子的氧化还原电流的变化进行DNA检测。
  非标记型杂交指示剂作为识别元素
  具有电活性的杂交指示剂与单链DNA和双链DNA以不同的结合能力或结合方式相互作用,它对双链DNA比对单链DNA有更高的特异性结合能力,可用来有效地区分单链DNA和双链DNA。一般地说,双链DNA与指示剂的相互作用为静电作用和内部疏水作用,而单链DNA主要是静电作用。目前使用的非标记型杂交指示剂主要包括有机染料、荧光素和药物小分子等。
  有机染料和具有强荧光性质的有机化合物是常见的一类电杂交指示剂。这类化合物一般都具有较大的蒽式刚性平面,并带有—OH、O、NH、N等电活性基团。目前常见的染料类杂交指示剂有灿烂甲酚蓝、亚甲基蓝、麦尔多拉蓝和吖啶酮衍生物等。Jiao等运用电方法研究了灿烂甲酚蓝与DNA的相互作用,DNA的加入使得灿烂甲酚蓝原有的氧化还原峰电流降低,峰电位负移,此为二者在试验条件下生成了一种非电活性的超分子化合物所致。该方法可用于DNA浓度的检测,其线性范围为8.0×10-7—6.0×10-5molL。Ozsoz等采用计时电位法和差示脉冲伏安法对亚甲基蓝与固定在碳糊电极上的小牛胸腺DNA的结合进行了研究,结果表明亚甲基蓝是一种DNA生物传感器的有效电活性杂交指示剂。Lin等采用亚甲基蓝作为杂交指示剂,对与慢性脊髓性白血病相关的18-碱基DNA(CMLDNA)序列进行了伏安测定,固定在玻碳电极表面的单链DNA可以选择性地与溶液中互补的CMLDNA结合,从而使得作为杂交指示剂的亚甲基蓝的峰电流有了显著的增大,并用于DNA浓度的测定,在1.25×10-7—6.75×10-7molL范围内呈线性关系,检测限为5.9×10-8molL。
  作为杂交指示剂的药物小分子大多属于蒽环霉素家族的成员,典型的有道诺霉素和阿霉素等。这类化合物由一个平坦的疏水四环素环和一个六碳氨糖组成,二者之间通过糖苷键相连。在生理条件下,这类化合物都带有正电,与DNA作用时,分子碳环部分通过嵌插模式作用于DNA螺旋结构中的碱基对,而氨糖部分与DNA外围的磷酸骨架发生静电作用。Hashimoto等利用这种杂交指示剂进行电基因检测,发现可以通过电活性小分子道诺霉素峰电位的移动,很好地区分双链和单链DNA,并且其电流密度相当高,可检测到10-8gml的靶基因序列。Pariente等用3,4-DHS和2,5-DHS这两个含有平面芳环的化合物作为杂交指示剂,相比较单链DNA,它们能更有效地结合双链DNA。光谱表征了这两种化合物均可与双链DNA的小沟结合;电测试表明3,4-DHS聚集在双链DNA层。该法可用来检测DNA浓度,在8.9—22.2μmolL范围内呈线性关系,检测限为8.3±0.4μmolL。
  二茂铁是优良的电媒介体,我们以聚噻吩二茂铁作为探针指示剂,将已知的带巯基的单链PNA片段固定于修饰电极上。因PNA缺少磷酸骨架,不能吸附带正电荷的聚噻吩二茂铁,但杂交后的PNA-DNA可以吸附聚噻吩二茂铁,产生很强的杂交信号,可以很好地识别互补的单链DNA。Won等制备了聚苯胺修饰电极,其表面在发生DNA杂交前呈中性,杂交后带负电荷。这样带负电荷的杂交指示剂二茂铁二羧酸在杂交前后在电极表面可引起电流变化,由此可以进行DNA的测定。
  另外,一些过渡金属络合离子可以与DNA的磷酸骨架或碱基结合,常用来作为杂交指示剂。如[Co(phen)33+]、[Co(bpy)33+]和[Ru(bpy)33+]等,它们能与DNA发生沟槽嵌入作用,并和磷酸骨架上的电荷发生静电作用。通过它们与DNA杂交前后产生不同的电信号来指示DNA的杂交情况。Mikkelsen等利用二吡啶钴离子与带负电荷的DNA骨架的静电结合能力,通过伏安法实现了DNA杂交检测。
  他们将DNA探针通过酰胺反应固定到碳糊电极表面,在较低盐浓度的电解液中加入了100μmolL的钴离子,发现当杂交反应发生后,钴离子的法拉第电流和充电电流都增大且电位负移了约30mV。电位负移是由于指示剂与双链DNA特异性结合后被固定在电极表面DNA层中,电流的增大则是由于杂交后电极表面DNA的密度增大,静电吸附的钴离子的量随之增加所致。Garcia等制备了双功能的钌配合物五氨基钌[3-(2-苯蒽酮-9-乙烯基)-嘧啶](RuL),配体中的芳环赋予配合物嵌插特征,使其对双链DNA具有更有效的结合作用,金属氧化还原中心可以作为杂交指示剂。在金电极表面固定螺旋菌中的巯基捕获探针序列制备了生物传感器,用于螺旋菌中的互补目标序列的检测,线性范围106—708pmolL。

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